蛋白複合物結構解析新方法 ─ Native top-down Mass Spectrometry

結構生物學家一直希望實現生物大分子結構的可視化，從而探索其功能。經驗證明，沒有一個單一的方法足以探讨在細胞中發生的動态行為和複雜的相互作用。核磁、晶體、冷凍電鏡在給出高分辨率結構信息的同時，在結構解析過程中會受到樣品量、樣品異質性、結構柔性、複合物大小等不同因素的限制。

結構生物學家需要其它方法來補充這些結構信息的空白，以提高他們對蛋白質的形态和功能的理解。最好的方法是将利用不同手段所獲取的低分辨到高分辨的信息進行整合，進而構建出難于用單一手段獲取的蛋白質機器的結構信息，即利用整合結構生物學（integrated structural biology）方法。 

質譜手段的優勢及現有技術的局限性

相對于核磁、晶體、冷凍電鏡技術，質譜具有靈敏、快速、高通量、适用于複雜樣品分析、不受複合物分子量大小限制等優勢，剛好可以填補其他結構生物學手段的空白。盡管獲取的結構信息的分辨率較低，但當于交聯、表面标記等手段相結合，可以用來獲取蛋白一維到四維結構信息。這些結構信息在整合結構生物學信息的整合過程中，起到重要的牽針引線的作用，實現多蛋白複合物骨架結構的構建及功能的探讨。  

整合結構生物學方法的不斷完善來源于各項技術的不斷進步。就質譜而言，常規native MS方法可以提供分子量、化學計量比、以及複合物中蛋白亞基的相互作用網絡關系。從方法上native MS與其他結構生物學方法互補性有目共睹，但從技術上它還有提升的空間：

(1)Native MS通常是在Q-TOF質譜上做的，很少給出序列信息，因此依賴于蛋白質組學 (多為bottom up proteomics) 實驗進行測序, 就是将蛋白酶解成小的肽段進行液質聯用分析。在肽段水平進行分析的優勢是快速、簡單、對儀器及技術要求低；劣勢則在于肽段在液相分離中的共流出以及離子化過程的競争性抑制，很多肽段并沒有被檢測出來。更重要的是，我們同時将同一基因對應的多個proteoforms (來源于RNA剪切和不同蛋白翻譯後修飾（PTMs）的各種組合)進行了剪切，PTMs間的組合信息會丢失，同時無法實現對于每個都可能具有不同功能的proteoform的有效區分。

(2)Native MS可以給出複合物中蛋白A和B之間相互作用的信息，但是不能給出具體作用位點或是區域，因此不能在結構信息整合過程中起到很好的限制性作用。

(3)在結構信息分辨率低、又有很多重要proteoforms/PTMs信息丢失的情況下，很難有效闡明PTMs對于蛋白質機器結構和功能的調節。

相對于bottom-up手段，我們還有top-down的質譜方法。就是不經過酶切，直接在質譜中進行分子量測定，并且利用不同串聯方式進行直接測序，可以最大程度上的區分不同proteoforms和定位PTMs。因此，這裡我們将native MS和top-down proteomics手段相整合，開發native top-down MS技術，在蛋白複合物整體水平直接進行測序分析，進而實現結構和蛋白質組學信息的同時獲取。

Native top-down MS有機地關聯蛋白複合物序列、結構、及功能信息

Native top-down MS的優勢在于：

 (1) 多維結構信息的同時獲取：除native MS可以獲取的信息外，可以直接得到序列，PTMs類型及位點，點突變, 配體類型及部分結合位點信息，區分proteoforms。

 (2) 特異性的結構信息 ：這裡除了采用傳統的基于碰撞的串聯方式外，我們還利用了基于電子及光子的串聯方式。電子捕獲解離(ECD)在斷裂骨架鍵的同時，可以保持非共價鍵及弱PTMs鍵的完整性，适用于蛋白非共價複合物研究。這裡我們可以特異性地獲取蛋白序列中N-, C-端的位置信息 (蛋白表面或是相互作用界面) 。 

 (3) 探讨PTMs對複合物結構和功能的影響。這裡我們充分探索了不同串聯及組合方式，解決了在蛋白複合物整體水平實現深度測序以及PTMs定位的經典難題，有機地将蛋白序列、結構、及功能相關聯。以糖原磷酸化酶（195kDa）、谷氨酸脫氫酶 (334kDa)、及β半乳糖苷酶（464 kDa）經典蛋白複合物為例，我們展示了native top-down MS方法的強大能力。同時對利用該手段所研究的十餘種蛋白複合物的結構規律進行了總結。

在蛋白複合物整體水平實現深度測序，将使得對内源性複合物的直接研究以及探索PTMs的特定功能成為可能。蛋白之間的相互作用是生物過程的核心，蛋白表面或是蛋白複合物相互作用界面信息的獲取将有助于增加結構生物學家對蛋白複合物結構和功能的了解。Native top-down質譜技術的核心是基于序列信息的獲取，進而獲取結構和功能信息。在未來，我們也将不斷拓展質譜技術及開發配套方法，進一步提升測序及PTMs精準定位水平，從而提供更高分辨率的結構信息，使得深入闡明PTMs對于蛋白複合物動态及功能調節成為可能。

此外，Native top-down MS技術與其他生物物理學手段如冷凍電鏡、計算機模拟等方法高度互補，這些結構信息的整合将有助于我們更加深入地研究蛋白質機器的結構和功能，推動結合生物學的發展以及藥物研發。

整合結構生物學技術的潛在問題及解決方案

結構生物學信息的整合在給蛋白質機器結構解析提供了無限前景的同時也存在潛在問題。如何在有效地利用各種方法提供的信息同時，避免信息整合過程中造成的錯誤的疊加，保證得到的模型的準确性、精度和可靠性則是整合結構生物學發展的核心問題。

Native top-down質譜新技術的加入，将提高結構生物學信息整合的有效性及準确性。而Native top-downMS與交聯、表面标記、離子淌度等技術的進一步整合，将可以使我們更深入的研究現有生物物理學手段有局限的領域。如前所述，質譜所提供的結構信息在結構生物學信息的整合過程中，起到重要的牽針引線的作用。我相信，在未來，整合結構質譜（integratedstructural MS）技術的不斷開發與完善是解決結構生物學信息整合過程中問題的關鍵。

詳見：An integrated native mass spectrometry and top-down proteomicsmethod that connects sequence to structure and function of macromolecularcomplexes

link: https://www.nature.com/articles/nchem.2908