我院王紅勝教授課題組在RNA m1A調控腫瘤代謝機制取得新進展
N1-甲基腺嘌呤（m1A）是RNA轉錄後的一種重要修飾，通過在腺苷酸的N1位添加甲基而形成。RNA m1A甲基化修飾被發現于19世紀60年代，過去認為m1A甲基化主要發生在rRNA和tRNA，參與RNA三級結構的維持并影響蛋白翻譯效率。近年來，通過高通量測序技術，發現m1A修飾同樣存在于mRNA。其可幹擾Watson-Crick堿基配對原則，表明m1A修飾的重要調節作用。然而，目前對于mRNA m1A修飾的生物學功能研究尚處于起步階段。
近日，王紅勝教授課題組在國際知名學術期刊《美國國家科學院院刊》(PNAS)以研究長文形式發表了題為RNA m1A methylation regulates glycolysis of cancer cells through modulating ATP5D 的研究論文（direct submission），發現m1A可通過調控線粒體ATP合酶F1結構域中δ亞基的組成部分ATP5D的表達調控腫瘤細胞糖酵解水平。m1A通過介導形成YTHDF1/eRF1/mRNA複合物抑制ATP5D的翻譯，同時通過調控轉錄因子E2F1的表達負向調控ATP5D mRNA的穩定性。利用dm1ACRISPR系統靶向去除ATP5D m1A修飾則上調ATP5D表達，從而引起腫瘤細胞糖酵解水平升高。這些結果揭示了mRNA m1A修飾與腫瘤代謝之間的調控關系，為腫瘤的治療提供了潛在的幹預策略。
能量代謝是細胞生命活動的基本特征之一，細胞能量代謝的重編程在腫瘤相關研究中日益受到關注。能量代謝作為腫瘤細胞的重要标志，Warburg效應指出不管氧氣是否存在，癌細胞都能最大限度依賴糖酵解來獲取能量。該團隊首先使用CRISPR/Cas9基因編輯技術及shRNA敲低m1A去甲化酶ALKBH3以構建m1A高水平腫瘤細胞模型，發現ALKBH3敲低腫瘤細胞葡萄糖消耗、乳酸生成、ATP水平及胞外酸化率（ECAR）顯著降低，進一步轉染ALKBH3 m1A去甲基化酶活性位點突變質粒A3-R122S、A3-L177A确認了以上生物學效應由m1A介導，以上結果說明m1A參與調控腫瘤細胞能量代謝。
為了探讨m1A調控腫瘤細胞能量代謝機制，該課題組通過mRNA-seq、m1A-seq及前期報道的m1A修飾的mRNA，發現m1A可能是通過調控關鍵基因ATP5D的表達介導腫瘤細胞能量代謝，ATP5D是線粒體ATP合酶F1結構域中δ亞基的組成部分，通過耦合質子轉運催化ATP的合成[。m1A-qPCR及ATP5D補救實驗确認了ATP5D在m1A調控腫瘤細胞能量代謝的關鍵作用，同時發現m1A在轉錄及翻譯層面調控ATP5D mRNA的生物學行為。利用ChIPBase、PROMO及JASPAR轉錄因子預測在線數據庫、啟動子熒光素酶報告基因系統、ChIP-qPCR及點突變實驗發現m1A調控表達的轉錄因子E2F1通過結合ATP5D啟動子-30～-23區域調控ATP5D的轉錄。
進一步，該課題組利用Co-IP、CLIP-PCR及Ribo-seq實驗鑒定出ATP5D m1A的識别效應蛋白為YTHDF1，它通過招募真核生物翻譯終止因子eRF1形成YTHDF1/eRF1複合物增強翻譯終止效率，從而抑制ATP5D的翻譯。為解析m1A抑制ATP5D mRNA翻譯的具體修飾位點，RNA fragmentation及m1A-qPCR首先鑒定出ATP5D的m1A修飾位點位于其CDS區域的1号外顯子上（Exon1）。課題組結合ATP5D Exon1的結構特點，将其中附近CG含量高的A（A53、A71、A105/106/109/111、A136）進行突變，發現m1A-71可能為調控ATP5D mRNA 翻譯的關鍵性修飾位點。随後利用選擇性去除m1A甲基化修飾工具dm1ACRISPR擦除A71的m1A，結果顯示ATP5D翻譯效率顯著升高，YTHDF1與eRF1之間的結合減少且腫瘤細胞葡糖糖消耗、乳酸生成及ATP生成增加，提示ATP5D Exon1區域的m1A-71是m1A調控ATP5D mRNA翻譯及介導腫瘤細胞能量代謝過程的關鍵甲基化位點。
圖1.m1A調控ATP5D轉錄及翻譯分子機制模式圖
研究進一步探讨體内外m1A/ATP5D對腫瘤進展的影響，發現敲低ALKBH3細胞的增殖、遷移、侵襲能力顯著降低及對阿黴素（DOX）、順鉑（CDDP）等化療藥物的敏感性降低。當在細胞中過表達ATP5D，上述效應則被逆轉。體内實驗表明敲低ALKBH3則顯著抑制腫瘤的生長，以及降低腫瘤組織中ATP5D的表達，但ATP5D過表達可有效逆轉上述作用。臨床分析發現，相較于癌旁組織，ALKBH3及ATP5D在癌組織中表達顯著升高，且在癌組織中二者表達水平呈正相關關系（P=0.044），ALKBH3或ATP5D表達水平高的患者有着更差的總生存期。
本研究深入解析了m1A調控ATP5D轉錄及翻譯的表觀遺傳機制，揭示了mRNA m1A修飾與腫瘤細胞能量代謝之間的調控關系，拓寬了對m1A調控mRNA生物學行為相關研究的認知，并為基于mRNA m1A修飾腫瘤幹預策略提供了理論依據及作用靶點。吳映敏、陳卓佳、謝國友為論文共同第一作者，王紅勝為論文獨立通訊作者。上述研究工作獲得國家自然科學基金等多項基金的資助及中山大學附屬腫瘤醫院陳麗昆教授、南方醫科大學珠江醫院牛紅心教授、北京大學伊成器教授等課題組的支持和幫助。
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